三代定序於粒線體 DNA 甲基化檢測的應用 

粒線體 (Mitochondria) 就像是人體發電廠，負責提供細胞能量來維持器官功能，許多重要生化反應都發生在粒線體當中，當粒線體發生缺陷 (Mitochondrial Defect)時，需要大量能量的器官就容易產生病變。常見的例子包含 Kearns-Sayre 氏症候群 (KS)、雷伯氏遺傳性視神經病變、眼部肌肉癱瘓、運動障礙等。通常粒線體 DNA (Mitochondria DNA , mtDNA) 的突變量要達到一定的量才會表現病癥，大約是高於 70% mtDNA 發生突變才會導致粒線體疾病。

造成粒線體疾病的基因變化可分為：mtDNA 點突變、mtDNA 大片段缺損，mtDNA 突變的累積、粒線體數目的變化等。以奈米孔定序 (Oxford Nanopore Technologies, ONT) 進行粒線體全基因定序，可精準找到特定具有變異的基因位點或片段。此外，在粒線體序列中，CpG 位置的甲基化改變與神經退行性疾病相關，例如：Alzheimer's disease (AD)、Parkinson's disease (PD) 與 amyotrophic lateral sclerosis (ALS) 等。除了遺傳之外，mtDNA 也會因環境而改變其甲基化程度。

過去透過 Bisulfite sequencing 的方式可偵測單一鹼基 DNA 甲基化，然而，mtDNA 的二級和三級結構可能會影響 bisulfite 轉化的 cytosines，進而影響甲基化程度的判斷，導致 mtDNA 甲基化程度被低估。為此劍橋大學團隊設計出一個更好的 protocol，使用奈米孔定序 (Oxford Nanopore Technologies, ONT) 來改善人類粒線體 DNA甲基化檢測。ONT 可針對長片段直接定序，並偵測序列中的甲基化位置，取代了傳統 bisulfite 轉化 cytosine 間接檢測甲基化的方式，搭配生物資訊的分析，可提供更客觀與精確的結果。

使用奈米孔定序 (Oxford Nanopore Technologies, ONT) 檢測 mtDNA 甲基化，after sample prep 的 Work Flow：

Ref:
1. Lüth T, Wasner K, Klein C, et al. Nanopore Single-Molecule Sequencing for Mitochondrial DNA Methylation Analysis: Investigating Parkin-Associated Parkinsonism as a Proof of Concept. Front Aging Neurosci. 2021;13:713084. Published 2021 Sep 28. doi:10.3389/fnagi.2021.713084
2. Pre-print: Oxford Nanopore sequencing-based protocol to detect CpG methylation in human mitochondrial DNA
https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.14.296269v1?ct= 
3. https://nanoporetech.com/lc/resource-centre/university-lubeck-germany 
4. https://nanoporetech.com/sites/default/files/s3/literature/epigenetics-workflow.pdf 
5. https://www.eurekalert.org/news-releases/852777 
6. https://www.mdpi.com/1422-0067/22/4/1811/pdf 
7. https://bmcmedgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12920-020-00853-3